Influence of different parameters on the formation of aroma-active compounds from ascorbic acid in model wines

Ascorbinsäure ist ein laut Verordnung (EU) 2019/934 Anhang I A Tabelle 2 Nummer 2.6 für die Weinbereitung zugelassener Behandlungsstoff. Die Höchstmenge im verkehrsfähigen Wein darf nicht mehr als 250 mg/l betragen. Der Zusatz von Ascorbinsäure zu Wein erfolgt dabei aus verschiedenen Gründen.

Zum einen soll der Zusatz eine mögliche Bildung der untypischen Alterungsnote (UTA) verhindern oder zumindest verlangsamen. Zum anderen dient die zugesetzte Ascorbinsäure als Antioxidans gegen etwaig in der Flasche bereits vorhandenen oder permanent durch den Verschluss eindringenden Sauerstoff (Schneider, 2013). Es muss bedacht werden, dass der Zusatz an Ascorbinsäure nicht ganz unkritisch gesehen werden kann. Denn Ascorbinsäure kann neben ihren positiven Wirkungen auch eine ganze Reihe von negativen Auswirkungen auf die Weinqualität haben, die in der Regel nicht direkt mit dem Zusatz von Ascorbinsäure assoziiert werden. Zum Verständnis dieser negativen Auswirkungen ist es notwendig, sich mit den chemischen Prozessen, die durch und mit Ascorbinsäure ausgelöst werden können, zu befassen.

Die Oxidation im Wein ist ein sehr komplexer Mechanismus. Trotzdem können einige kritische Faktoren benannt werden, die für einen Oxidationsvorgang im Wein unerlässlich sind. Hier sind zu nennen: Sauerstoff, Eisen, Kupfer, Mangan, freies Schwefeldioxid (SO₂) sowie Phenole und Ascorbinsäure. Grundsätzlich ist zu bemerken, dass Sauerstoff, so wie er natürlicherweise in der Umgebungsluft vorliegt, eher als reaktionsträge zu bezeichnen ist (Danilewicz, 2003). Er muss für eine Reaktion erst durch andere Stoffe aktiviert werden. Hierfür sind in erster Linie die Übergangsmetalle Eisen, Kupfer und Mangan verantwortlich, die in jedem Wein natürlich vorkommen oder, wie das Kupfer, zur Böckser-Behandlung und -Vermeidung während der Weinherstellung zugesetzt werden (Funk, 2003; Margalit, 2012).

Generell geht die Oxidation weniger vom Sauerstoff selbst als vom Eisen aus. Das Eisen in seiner dreiwertigen Form übernimmt vom SO₂ ein Elektron, so dass es selbst in die zweiwertige Form übergeht. Das um ein Elektron beraubte SO₂ hingegen bildet ein Radikal, eine äußerst reaktive Zwischenstufe. Und erst dieses Radikal ist es, welches in einem zweiten Schritt mit dem Sauerstoff reagiert und diesen dabei aktiviert (Abb. 1). Man könnte es auch so formulieren, dass ausgerechnet diejenige Substanz, die man eigentlich zum Schutz des Weines vor Oxidation hinzufügt, nämlich das SO₂, die Oxidation des Weines überhaupt erst ermöglicht. Dies ist ein gedankliches Paradox, das nicht gleich verständlich erscheint.

Abb. 1:

Reaktion des Sulfits mit Eisen und Sauerstoff (Danilewicz und Wallbridge, 2010)

Das aus SO₂ und Sauerstoff gebildete Radikal ist ebenfalls äußerst reaktiv und sucht sich weitere Reaktionspartner. Es kann nun durch ein weiteres SO₂-Molekül abgefangen und so entschärft werden oder aber, wenn kein SO₂ mehr im Wein vorliegen sollte, mit Wasser unter Bildung von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) reagieren. H₂O₂ ist ein sehr starkes Oxidationsmittel und reagiert bevorzugt mit Ethanol zu Acetaldehyd, der Wein wird „luftig“. Mit Aromen oder Phenolen reagiert H₂O₂ zu den jeweiligen oxidierten Verbindungen. Der Wein verliert in der Folge an Frische und zeigt eine mehr oder weniger deutliche Braunfärbung (Pour Nikfardjam, 2010).

Während sich die Phenole aus ihrer oxidierten Form, den sogenannten Chinonen, durch den Einsatz von SO₂ wieder in ihre Ausgangsform versetzen lassen (Abb. 2), gelingt dies bei der oxidierten Form der Ascorbinsäure, der Dehydroascorbinsäure (DHA), leider nicht, da diese unter oxidativen Bedingungen zügig weiter oxidiert wird (Matissek, 2019). Der Einsatz von Ascorbinsäure ist daher eine einmalige Angelegenheit; die Substanz steht also nicht wie die Phenole durch eine Rückreaktion über SO₂ nochmals für weitere Einsätze zur Verfügung. Auch muss festgehalten werden, dass Ascorbinsäure nicht ganz so effektiv mit Sauerstoff reagiert, wie dies SO₂ tut (Danilewicz et al., 2008). Dies liegt ursächlich im unterschiedlichen Redoxpotenzial beider Substanzen begründet. Im Falle der Ascorbinsäure liegt das Standard-Elektrodenpotenzial bei +0,490 V (Heimann und Wisser, 1962) und für SO₂ bei +0,16 V (Binnewies et al., 2016).

Abb. 2:

Oxidation der Phenole (Pour Nikfardjam, 2010)

Darüber hinaus kann Ascorbinsäure zu einer Vielzahl von aromaaktiven Verbindungen abgebaut werden. Hier ist einerseits die Substanz Sotolon zu nennen, ein Aromastoff, der Sherries, Madeira- und Portweinen ihren charakteristischen oxidierten Geruch verleiht. Darüber hinaus ist die Substanz prägend für das Aroma von Liebstöckel („Maggi-Aroma“) und Bockshornklee, aber auch für Karamell, verbrannten Zucker und Ahornsirup.

In Versuchen konnte gezeigt werden, dass Ascorbinsäure unter oxidativen Bedingungen zur 2-Ketobuttersäure (2-Oxobutansäure) abgebaut wird und diese als Vorstufe für die Weiterreaktion mit Ethanol zu Sotolon dient (König et al., 1999; Pons et al., 2010). In weitergehenden Untersuchungen bestätigte sich, dass bereits ein Zusatz von 80 mg/l Ascorbinsäure zu Weinen, die in Flaschen mit Supremcorq, einem synthetischem Korken, gelagert wurden, zu einer Bildung von 1 μg/l Sotolon innerhalb der ersten 18 Monate führen kann und damit den Geruchsschwellenwert von 2 μg/l des Racemats von Sotolon in wässriger Lösung mit 12 %vol. Ethanol wahrscheinlich überschreitet (Pons et al., 2008; Pons et al., 2015).

Zu den weiteren Abbauprodukten gehören Ethyl-2-furoat, Furfural und 3-Hydroxy-2-pyron, deren geruchliche Charakteristika von Vanille, über Karamell und gebackenes Brot bis hin zu Lakritze reichen (Pisarnitskii, 2001; Vel'sek et al., 1976). Insgesamt sind sie daher eher für reifere Aromatiken verantwortlich, als dass sie den frischen Eindruck eines Weines verstärken würden. Ihre Bildung ist folglich durchaus kritisch zu sehen, da sie das Potential besitzen, einem Wein die Frische zu rauben oder zumindest zu überdecken, obwohl die Ascorbinsäure eigentlich zum Erhalt des frischen Aromas eingesetzt wird.

Für uns stellte sich im durchgeführten Projekt daher die Frage, welchen Einfluss Temperatur, SO₂ und pH-Wert auf die Bildung der oben genannten aromaaktiven Verbindungen aus unterschiedlichen Ascorbinsäure-Ausgangskonzentrationen haben. Dies wurde in Modelllösungen in einem Design of Experiments (DoE) Screening Design durchgeführt, um ein möglichst einfaches System mit geringen Synergismen vorliegen zu haben. Sotolon wurde aufgrund der erforderlichen komplexen Analytik nicht in die weiteren Betrachtungen einbezogen.

L(+)-Ascorbinsäure 99,0-100,5 % und L(+)-Weinsäure 99,7 % stammen von VWR International BV (Leuven, Belgien). Von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) wurden die Substanzen Natriumchlorid (zur Analyse), Kaliumdisulfit (EMSURE zur Analyse, Supelco) und Natronlauge erhalten, und von Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Deutschland) wurde das Ethanol ≥ 99,8 %, p.a. bezogen. Zur Gaschromatographie wurde Helium von Air Products GmbH (Hattingen, Deutschland) verwendet.

Mittels einer Headspace-Solid-Phase-Micro-Extraction-Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse (HS-SPME-GC-MS-Analyse) wurden die Probenlösungen analysiert. Die Geräteeinstellungen sind der Tab. 1 zu entnehmen. Zur Analyse stand der Gaschromatograph Clarus 690 mit dem TurboMatrix MultiPrep+ #1 Autosampler und dem Massenspektrometer Clarus SQ 8T mit El-lonisation von PerkinElmer (Shelton, USA) zur Verfügung. Der Quartz Liner for splitless Operation (ID=1 mm, OD=4 mm, Länge=86,2 mm) ist auch von PerkinElmer (Shelton, USA). Die SPME Faser (Carbon Wide Range/PDMS, Faserdicke: 95 μm, Faserlänge: 10 mm) zur Extraktion der Analyten wurde von Restek Pal (Zwingen, Schweiz) bezogen. Zur Trennung der Analyten diente die Elite-WAX Capillary Column (Polyethylenglycol 30 m x 0,32 mm ID x 0,5 ^m, 20-250 °C) von PerkinElmer (Shelton, USA). Die Auswertung der Chromatogramme wurde mittels der Software TurboMass Version 6.1.2 von PerkinElmer (Shelton, USA) durchgeführt.

Die Bildungskinetik der drei analysierten Abbauprodukte ist in der Abb. 3 dargestellt. Zunächst fällt auf, dass die Bildung aller drei Substanzen hauptsächlich temperaturabhängig ist. Die Modellweine, die bei der klassischen Wein-Lagertemperatur von 12 °C aufbewahrt wurden, bilden später und in deutlich geringerer Menge die entsprechenden Abbauprodukte. Die Bildungskinetik verläuft für die kühl gelagerten Proben für Ethyl-2-furoat und Furfural näherungsweise linear. Die Proben, die bei einer Temperatur von 30 °C gelagert worden sind und somit Extremsituationen während der Lagerung nachstellen, wie sie zum Beispiel auf Transportwegen erreicht werden könnten, verzeichnen eine deutlich schnellere Bildung der Abbauprodukte. Der Verlauf der Ethyl-2-furoat-Bildung ist exponentiell, die der anderen Verbindungen eher linear. Ab der Woche sieben bzw. für das 3-Hydroxy-2-pyron ab der Woche drei erfolgt nach diesem Zeitpunkt kein nennenswerter Anstieg mehr. Möglicherweise wurde bis zu diesem Zeitpunkt die gesamte Ascorbinsäure als Substrat der Verbindungen bereits vollständig aufgebraucht. Die Kontrollproben, die bei Raumtemperatur gelagert wurden, das heißt die Lagertemperatur, welche meistens im Verkauf und beim Verbraucher zu Hause erreicht wird, liegt im Verlauf zwischen den kalt- und warmgelagerten Proben. Die Bildungskinetik ist vergleichbar zu den kaltgelagerten Proben, weshalb eine Lagertemperatur, die kleiner oder gleich der Raumtemperatur ist, offensichtlich langsamer zur Bildung von Abbauprodukten führt, als dies bei höheren Temperaturen der Fall ist. Außerdem fällt auf, dass die warmgelagerten Proben stärker verschieden große Mengen an Abbauprodukten bilden als die kühlgelagerten Proben.

Abb. 3:

Bildungskinetik der Ascorbinsäure-Abbauprodukte

Ein weiterer auffälliger Faktor, der einen sichtbaren Einfluss auf die Bildungskinetik der drei Verbindungen hat, ist der pH-Wert. Werden die Modellweinmatrices für Weiß- und Rotwein miteinander verglichen, zeigt sich, dass die Kurvenverläufe der Rotweinmatrix allgemein niedriger als die der Weißweinmatrix liegen. Folglich scheint ein hoher pH-Wert eine hemmende Wirkung auf die Bildung der Abbauprodukte zu haben. Da Ascorbinsäure jedoch eher bei Weinen mit niedrigem pH-Wert eingesetzt wird (Weiß-/Roséweine), kann hier ein deutlich stärkerer Abbau stattfinden.

Der Einfluss der SO₂-Konzentration ist für die Bildung des Ethyl-2-furoats offenbar eher zu vernachlässigen. Jeweils ähnliche Proben mit unterschiedlicher SO₂-Konzentration besitzen auch in ihrer Kinetik ähnliche Kurvenverläufe. Für Furfural und für 3-Hydroxy-2-pyron gilt dies hingegen nicht. Furfural wird vermehrt bei einem höheren SO₂-Gehalt gebildet und 3-Hydroxy-2-pyron bei einem niedrigeren Gehalt.

Die Ascorbinsäure selbst hat dabei einen positiven Einfluss auf die Bildung der Abbauprodukte. Dies hängt ursächlich damit zusammen, dass mehr Substrat vorliegt.

Darüber hinaus konnten auch sensorische und visuelle Veränderungen der Proben festgestellt werden. Ab der dritten Lagerwoche wurde bei einigen Proben ein süßlicher, an Karamell erinnernder Geruch wahrgenommen. Der Geruch ist vergleichbar mit der sensorischen Beschreibung der Ascorbinsäure-Abbauprodukte. Ob der Geruch dem Sotolon zuzuordnen ist oder den anderen drei beschriebenen Abbauprodukten, kann nicht eindeutig bestätigt werden. Der Geruchsschwellenwert des Sotolons liegt bei 2 μg/l in wässriger Lösung mit 12 %vol. Ethanol (Pons et al., 2008) und ist deutlich niedriger als die der anderen drei Verbindungen, die mit Ausnahme des Furfural im Milligramm-Bereich liegen (Burdock, 2010; Shaw et al., 1970; Sun et al., 2018). Mit der Zugabe von 125 und 250 mg/l Ascorbinsäure zu den Modellweinproben ist es durchaus möglich, dass die genannten Schwellen erreicht werden können (Pons et al., 2015). Ob eine synergistische Wirkung der Verbindungen untereinander vorliegt, ist nicht bekannt. Weiterhin konnte eine Gelbfärbung der Probenlösungen festgestellt werden. Diese trat vor allem in Proben mit einem hohen pH-Wert und bei einer Lagertemperatur von 30 °C auf. Die gelbliche Färbung kann vermutlich auf die Bildung von Furfural (Burdock, 2010) und DHA zurückgeführt werden (Teichmann und Ziebarth, 1966).

In den Tab. 4 und 5 ist die statistische Auswertung aller Daten dargestellt. Ihr ist zu entnehmen, dass signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Parametern und den Verbindungen vorliegen. Es ist hervorzuheben, dass die Temperatur auf alle drei Verbindungen und jeweils in beiden Matrices den stärksten hochsignifikanten Einfluss hat. Daran schließt sich der Einfluss des pH-Wertes und der Ascorbinsäure-Konzentration mit ungefähr gleichen Signifikanzniveaus an. Insgesamt weist die SO₂-Konzentration allgemein das geringste Signifikanzniveau auf.

In der Abb. 4 wird der prozentuale Beitrag der vier Faktoren an der Bildung der Ascorbinsäure-Abbauprodukte dargestellt, und es können die zuvor beschriebenen Abhängigkeiten und Signifikanzen bestätigt werden. Die Temperatur- und pH-Wert-Abhängigkeit, die auch schon Veli'sek et al., 1976, Yuan und Chen, 1998 und Izquierdo-Cañas et al., 2020 festgestellt haben, konnten ebenfalls beobachtet werden. Allgemein weisen Ethyl-2-furoat und Furfural größere Ähnlichkeiten zueinander auf. Aus der Abb. 4 geht zusätzlich hervor, dass SO₂ auf die Bildung des 3-Hydroxy-2-pyron einen deutlichen, wenn auch nicht statistisch signifikanten Einfluss hat (vgl. Tab. 4). Je geringer der SO₂-Gehalt ist, desto mehr 3-Hydroxy-2-pyron bildet sich. Hinzu kommt, dass dieser Einfluss nur bei niedrigeren pH-Werten vorliegt und bei höheren pH-Werten weitestgehend in den Hintergrund tritt, da weniger freies SO₂ vorliegt (Belitz et al., 2008). Die Bildung des 3-Hydroxy-2-pyrons ist damit ursächlich mit dem Vorliegen von molekularer SO₂ verbunden.

Abb. 4:

Prozentualer Beitrag der vier Parameter auf die Bildung der Ascorbinsäure-Degradationsprodukte in den Modellwein-Lösungen für Weiß- und Rotwein-Modellweinmatrix nach acht Wochen, ausgewertet nach einem Screening Design

Die erläuterten Abhängigkeiten können nun in einen Zusammenhang mit den Reaktionsmechanismen gebracht werden. Mit Ausnahme des Furfural bilden sich die Abbauprodukte ausgehend von der DHA. Ihr Bildungsweg (Abb. 5) kann durch Licht, Sauerstoff, Metallionen und Temperatur beeinflusst werden. Die Proben wurden im Dunkeln in Weißglas gelagert, sodass sie nur während der Messzeiten Licht ausgesetzt wurden. Zum Ansetzen der Proben wurde doppelt entmineralisiertes Wasser verwendet, wodurch ein Eintrag von Metallionen nahezu ausgeschlossen ist. Das Schütteln vor jeder Probennahme und die wöchentliche Zunahme des Kopfraums im Probenkolben, sind für alle Proben gleich. Damit können diese Parameter als Verursacher ziemlich sicher ausgeschlossen werden.

Abb. 5:

Reaktionsmechanismus zur Bildung der DHA (Basak et al., 2023)

Folglich hat auf die Bildung von DHA insbesondere der Temperaturunterschied einen Einfluss. Die Reaktion zur DHA ist irreversibel, da kein Reagenz zur Regeneration dieser vorliegt (Njus et al., 2023). Weiterhin oxidiert DHA zur 2,3-Diketogulonsäure (Matissek, 2019; Richardson und Finley, 1985). Die von Sheraz et al., 2015 beschriebene katalysierende Wirkung eines pH-Wertes bei 4,0 auf die Bildung der DHA scheint hier keinen Einfluss zu haben, da die Modellweinproben mit einem niedrigeren pH-Wert schneller Abbauprodukte gebildet haben als die mit einem höheren pH-Wert.

Ausgehend von der 2,3-Diketogulonsäure findet eine Decarboxylierung, eine Umlagerung und eine Kondensationsreaktion statt. Die gebildete 5-Hydroxy-2-oxo-pent-3-en-caboxylsäure reagiert durch eine 2,5-Cyclisierung und anschließender Wasserabspaltung zur 2-Furancarboxylsäure oder durch eine 2,6-Cyclisierung, anschließender Wasserabspaltung und Umlagerung zum 3-Hydroxy-2-pyron (Abb. 6) (Basak et al., 2023; Yuan und Chen, 1998).

Abb. 6:

Reaktionsmechanismus zur Bildung der Abbauprodukte 2-Furancarbonsäure und 3-Hydroxy-2-pyron ausgehend von der DHA (Basak, Shaik, & Chakraborty, 2023; Yuan & Chen, 1998)

Da in Wein Ethanol vorliegt, reagiert die 2-Furancarboxylsäure innerhalb einer säurekatalysierten Fischerveresterung weiter zum Ethyl-2-furoat (Abb. 7) (Flavouring Group, 2005; Pisarnitskii, 2001).

Abb. 7:

Säurekatalysierte Fischerveresterung der 2-Furancarboxylsäure zu Ethy-2-furoat mit Ethanol

Wird der Reaktionsmechanismus des Ethyl-2-furoats betrachtet, haben vor allem die Temperatur und der pH-Wert einen großen Einfluss. Beide Parameter verschieben während der Veresterung das Gleichgewicht auf die Seite des Esters. Die SO₂-Konzentration hat insbesondere einen Einfluss auf den Oxidationsschritt zu Beginn zur DHA und weiter zur 2,3-Diketogulonsäure. Auf diese Reaktionen wirkt sie inhibierend, wodurch sich in den Modellweinproben mit einer niedrigeren SO₂-Konzentration, aber sonst gleichen Parametern, kleinere Mengen an Abbauprodukten gebildet haben. Da die Veresterung reversibel ist, kann dies zu einem Abbau am Ende der Versuchszeit geführt haben.

Obwohl sich die Bildung des 3-Hydroxy-2-pyrons erst am Ende des Mechanismus von der Bildung des Ethyl-2-furoats unterscheidet, sind die Kurvenverläufe und der Beitrag der Parameter an der Bildung verschieden. Der Abb. 7 ist zu entnehmen, dass bei niedrigeren pH-Werten, die in den Weißwein-Modellweinproben vorlagen, die Temperatur einen kleineren Beitrag an der Bildung des 3-Hydroxy-2-pyrons hat, jedoch der Einfluss des SO₂ verstärkt wird. Bei niedrigeren pH-Werten können weniger Bisulfit-Addukte gebildet werden, wodurch mehr 3-Hydroxy-2-pyron entstehen kann. Besonders die drei Zwischenprodukte, bevor sich 3-Hydroxy-2-pyron bildet, weisen olefinische Doppelbindungen auf, mit denen SO₂ Addukte bilden kann (Nursten, 2005). Zuletzt ist der Pyran-Ring weniger stabil, wodurch der Kurvenverlauf in den letzten vier Wochen weniger stabil ist als der des Ethyl-2-furoats.

Furfural kann als einzige Verbindung anaerob direkt aus der Ascorbinsäure gebildet werden. In der Abb. 8 sind die Bildungswege des Furfural dargestellt. Es wird deutlich, dass eine hohe Temperatur die einzelnen Kondensationsreaktionen katalysiert und ein niedriger pH-Wert sich positiv auswirkt. Auch hier hat SO₂ einen Einfluss auf die Bildung, indem es Addukte mit den Zwischenprodukten bilden kann. Hierbei ist zu unterscheiden, dass sich mit Furfural nur eine reversible Bindung zu SO₂ bilden kann, sich hingegen mit Zwischenprodukten des Bildungsweges durchaus auch irreversible Addukte bilden können (Adams, 1997 zitiert nach Wallington et al., 2013; Wedzicha, 1984 zitiert nach Wallington et al., 2013). Zudem ist das Furfural-Bisulfit-Addukt mit zunehmender Temperatur weniger stabil, wodurch mehr Furfural in erwärmten Proben vorliegt (Makarov et al., 1997; Wallington et al., 2013). Dass Wärme zu mehr Furfural führt, kann bestätigt werden. Zwar zeigt die Auswertung nach dem DoE Screening Design eine SO₂-Abhängigkeit; werden jedoch die Graphen betrachtet, ergibt sich, dass höhere SO₂-Konzentrationen nicht hemmender wirken. Diese Wirkung tritt gegenüber des Einflusses der Temperatur und des pH-Werts in den Hintergrund.

Abb. 8:

Ascorbinsäure-Degradationsweg zu Furfural (Basak et al., 2023; Kurata und Sakurai, 1967)

Die vorgestellten Ergebnisse und Betrachtungen zeigen, dass der Einsatz von Ascorbinsäure im Wein nicht ganz unkritisch zu sehen ist. Die drei untersuchten Abbauprodukte weisen in ihrer Bildung eine deutliche Abhängigkeit von verschiedenen Parametern auf. So kann deren Bildung in Modellwein durch eine kühle Lagerung bei 12 °C stark minimiert werden. Ein hoher pH-Wert wirkt ebenfalls hemmend und eine SO₂-Zugabe verhindert die Bildung des 3-Hydroxy-2-pyron zusätzlich. Da Ascorbinsäure jedoch in der Regel bei Weinen mit niedrigem pH-Wert zum Einsatz kommt (Weiß-/Roseweine), besteht hier offenbar einen größeres Potential für die Bildung der vorgestellten Abbauprodukte. Bei diesen Weinen sollte folglich besonders auf die Einhaltung einer niedrigen Lagertemperatur geachtet werden, um die Bildung der aromaaktiven Abbauprodukte nicht zu forcieren. Zwar handelt es sich bei den vorgestellten Ergebnissen nur um erste Untersuchungen in Modellwein-Lösungen; die Ergebnisse zeigen jedoch erste Problemfelder auf, die bei der Verwendung von Ascorbinsäure als Antioxidationsmittel im Wein dringend Beachtung finden sollten.