Microbial Culture Collections and Microbiological Biobanks in the Context of New ISO Standards

Tempo postępu biotechnologii prowadzi do dynamicznego wzrostu ilości danych i informacji naukowych, w tym mikrobiologicznych, genotypowych i fenotypowych. Kolekcje czystych kultur drobnoustrojów oraz Centra Zasobów Mikrobiologicznych, zwane także biobankami mikrobiologicznymi (Tabela I), odgrywają kluczową rolę w ochronie i obiegu zasobów mikrobiologicznych oraz powiązanych z nimi danych. Mają one zasadnicze znaczenie dla postępu nauk przyrodniczych i biogospodarki [8, 22]. Kolekcje są odpowiedzialne za gromadzenie, selekcję, przechowywanie i rozpowszechnianie danych i informacji związanych z powierzonym materiałem biologicznym spełniając przy tym wysokie standardy jakości i wiedzy specjalistycznej wymaganej przez międzynarodową społeczność naukowców i przemysłu. Takie zadania wymagają wieloaspektowego podejścia zarówno w zarządzaniu materiałami oraz informacją, a także opracowania nowych metodologii w celu zapewnienia jakości procedur.

Biobanki różnią się znacznie pod względem rodzaju posiadanego materiału biologicznego, podejmowanych działań, świadczonych usług, a także ich położenia geograficznego, wielkości i struktury. W ostatnim czasie Komitet Techniczny ISO/TC 276 Biotechnologia dążąc do wprowadzenia uzgodnionych na szczeblu międzynarodowym wspólnych wytycznych opracował normy dotyczące prowadzenia biobanków, aby stworzyć ogólnoświatowe zrozumienie jakości, zaufania, niezawodności i poprawić wydajność biobanków [13].

Miliony gatunków drobnoustrojów zasiedlające naszą planetę stanowią nieprzebrane źródło biologicznej różnorodności, ważnej zarówno z powodów naukowych, jak też komercyjnych. Mikroorganizmy są podstawą wielu dziedzin działalności człowieka i odgrywają kluczową rolę w wielu sektorach biogospodarki. Są wykorzystywane do produkcji żywności, biopaliw i energii elektrycznej, ochrony roślin i zwierząt, przekształcania odpadów organicznych, a także biosyntezy istotnych substancji takich jak antybiotyki, leki, enzymy, witaminy, czy barwniki.

Światowe kolekcje kultur już od ponad 100 lat gromadzą materiał biologiczny i podejmują badania interdyscyplinarne. Do zadań CC należy pozyskiwanie, analizowanie, długoterminowe przechowywanie oraz dystrybucja zgromadzonego materiału biologicznego wraz z powiązanymi danymi. Do kręgu zainteresowań CC należą szczepy bakterii, drożdży, grzybów strzępkowych, bakteriofagi, algi wykazujące szczególne właściwości przydatne w procesach biotechnologicznych i/lub przedstawiające inną wartość naukową bądź technologiczną. Poza tym istnieją kolekcje deponujące linie komórkowe, kwasy nukleinowe (genomowy i plazmidowy DNA, wektory lub geny). Kolekcje kultur odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności fizjologicznej, biotechnologicznej i genetycznej materiału biologicznego. Powyższy cel realizowany jest m.in. przez dobór odpowiedniej metody konserwacji i przechowywania, okresową kontrolę materiału biologicznego, a także walidację stosowanych metod i procedur. Na świecie istnieje wiele rodzajów CC, o różnym potencjale, statusie i zasięgu. Publiczne CC dostarczają swoje produkty i usługi społeczeństwu. Z kolei badawcze CC świadczą usługi istotne dla podmiotów badawczych tj. instytutów naukowych i uczelni. Pomimo znacznych różnic dotyczących pochodzenia zasobów kolekcji, przeznaczenia, a także źródła finansowania czy rodzaju interesariuszy, wszystkie CC mierzą się z podobnymi wyzwaniami związanymi ze stabilnością finansową oraz gwarancją jakości przechowywanego materiału biologicznego i związanych z nim danych.

Podążając za strategią bardziej ekologicznego, zdrowszego i zrównoważonego środowiska, opartego na ochronie, badaniu i waloryzacji zasobów mikrobiologicznych i bioróżnorodności powołano do istnienia tzw. Centra Zasobów Mikrobiologicznych. MRCs są uważane za jeden z kluczowych elementów zrównoważonej międzynarodowej infrastruktury naukowej, która jest niezbędna, aby zapewnić dostarczanie korzyści płyną-cych z biotechnologii, zarówno w sektorze zdrowia, przemyśle i innych ważnych obszarach biogospodarki [14]. Centra Zasobów Mikrobiologicznych stanowią najbardziej aktualną i nowoczesną formę CC. Są to podstawowe infrastruktury przechowujące i zarządzające zasobami mikrobiologicznymi w celu zagwarantowania ochrony różnorodności mikrobiologicznej i zapewnienia źródeł drobnoustrojów dla badań i przemysłu [22]. Poza utrzymywaniem i dystrybucją zasobów biologicznych oferowanych przez typowe CCs, MRCs zapewniają produkty i usługi, które wykraczają daleko poza utrzymanie i dystrybucję zasobów mikrobiologicznych oferowanych przez typowe CC. Opierają się na określonych i zatwierdzonych procedurach zapewniania jakości, zapewniają głęboką wiedzę fachową w zakresie systematyki drobnoustrojów oraz utrzymują wiedzę prawną w zakresie praw własności i bio-bezpieczeństwa.

Kolekcje kultur drobnoustrojów mogą przekształcić się w MRCs, jeśli sprostają różnego rodzaju wyzwaniom. Należą do nich: zapewnienie stabilności finansowej, zgodność z prawodawstwem, wdrożenie systemu zarządzania jakością (Quality Management System – QMS), zwiększenie dostępu do informacji, technologii, szkoleń, zasobów biologicznych, czy ekspertyz taksonomicznych i bioinformatycznych.

CCs osiągają status MRCs po wdrożeniu zarówno wytycznych dotyczących najlepszych praktyk określonych przez Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (Organisation for Economic Cooperation and Development – OECD), Światową Federację Kolekcji Kultur (World Ferderation for Culture Collection – WFCC), jak i certyfikację i/lub akredytację zgodnie z odpowiednimi normami [24]. W wyniku tego MRCs działają w sposób kontrolowany pod względem jakości wymaganej przez przemysł i społeczność naukową [16, 10]. To sprawia, że MRCs są kluczowymi elementami zrównoważonej międzynarodowej infrastruktury naukowej dla rozwoju biotechnologii i biogospodarki, a także odgrywają kluczową rolę dla wyzwań społecznych.

Jednym z zadań MRC powinno być włączanie się w projekty inwestycyjne sektora biotechnologicznego oraz wspieranie rozwoju regionu, w którym są zlokalizowane. Wychodząc naprzeciw tym zadaniom, MRCs włączają do podstawowej działalności depozyty bezpieczne i/lub patentowe [2]. Dla MRCs strategiczne jest zatem zachowanie reprezentatywnych i typowych szczepów drobnoustrojów, a także ich potencjalnej wartości dla przemysłu, medycyny, rolnictwa lub działalności naukowej [3].

Wdrożenie systemu zarządzania jakością jest jednym z najważniejszych wyzwań podejmowanych przez kolekcje, ponieważ ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia jakości zasobów mikrobiologicznych. W oparciu o QMS, CCs są w stanie dostarczać materiały mikrobiologiczne o gwarantowanej jakości, która jest zgodna z krajowymi i międzynarodowymi ramami prawnymi (np. „Konwencją o różnorodności biologicznej”, „Protokołem z Nagoi o dostępie i podziale korzyści”, przepisami i zezwoleniami dotyczącymi opakowań i wysyłki, itp.) [22].

Do niedawna CCs wdrażając system zarządzania jakością korzystały z:

• Zaleceń WFCC „Guidelines for the Establishment and Operation of Collections of Cultures of Microorganisms”;

• Zaleceń OECD „Best Practice Guidelines for Biological Resource Centres”;

• Zaleceń GLP (Good Laboratory Practice);

• norm ISO serii 9000 „Systemy zarządzania jakością – Wymagania”;

• normy ISO/IEC 17025 „Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących”;

• normy ISO 17034 „Ogólne wymagania dotyczące kompetencji producentów materiałów odniesienia”.

W ostatnim czasie powstaje panel specyficznych norm dla biobanków/CCs opartych o powyższe wytyczne i normy.

Wytyczne WFCC dotyczą tworzenia i działania kolekcji mikroorganizmów. Zawierają szereg zagadnień z zakresu organizacji obejmujących: cele, fundusze, zakres działalności, prowadzenie dokumentacji, katalogów, szkoleń, obsługi kolekcji drobnoustrojów (prze-chowywanie, potwierdzanie autentyczności, pozyskiwanie i udostępnianie szczepów), a także bezpieczeństwa, ochrony, współpracy międzynarodowej i przepisów prawa. Po wewnętrznym wdrożeniu tych zasad CCs powinny przejść do stosowania wymogów i wytycznych OECD dotyczących najlepszych praktyk lub różnego rodzaju norm i certyfikatów [23, 12]. Przewodnik OECD stanowi opis zasad dobrej praktyki laboratoryjnej we wszystkich rodzajach BRCs (Tabela I). Jeden z rozdziałów pt. „Best Practice Guidelines for the Micro-organism Domain” poświęcony jest wymaganiom skierowanym do kolekcji mikroorganizmów. Obejmuje on zagadnienia z zakresu m.in. kwalifikacji i szkoleń personelu, sprzętu, kalibracji, odczynników i pożywek, pozyskiwania, przechowywana i udostępniania szczepów. Pozostałe dokumenty opisują ogólne wytyczne dotyczące systemu jakości związanego z dostarczaniem wyrobów i usług biorąc pod uwagę kluczowe kwestie, tj. wprowadzenie nadzoru nad dokumentacją i zapisami, zaangażowanie kierownictwa w budowanie systemu zarządzania jakością, usystematyzowanie zarządzania zasobami, ustanowienie procesów realizacji wyrobu, dokonywanie systematycznych pomiarów (zadowolenia klienta, wyrobów, procesów).

Aktualnie CCs/biobanki, które chcą uzyskać akredytację i osiągnąć status wysokiej jakości, mogą korzystać z dokumentów bezpośrednio dla nich dedykowanych. Część z nich jest opublikowana i dostępna dla biobanków, zaś niektóre znajdują się jeszcze w fazie projektu. Komitet Techniczny ISO/TC 276 Biotechnologia opracowując poniższe normy, dąży do wprowadzenia uzgodnionych na szczeblu międzynarodowym wspólnych wytycznych. W 2018 roku opublikował normę ISO 20387 – Biotechnologia – Biobankowanie – Ogólne wymagania dotyczące biobankowania. Norma może być stosowana przez wszystkie organizacje prowadzące biobanki materiału biologicznego z organizmów wielokomórkowych (np. ludzi, zwierząt, grzybów i roślin) oraz mikroorganizmów do badań i rozwoju. Nie odnosi się jednak do materiału biologicznego przeznaczonego do produkcji żywności/pasz, laboratoriów zajmujących się analizą żywności/pasz i/lub zastosowaniami terapeutycznymi. Celem normy jest promowanie zaufania do biobanków oraz określenie wymagań dotyczących kompetencji w zakresie ich działalności, w tym dostarczania materiału biologicznego oraz danych odpowiedniej jakości dla badań i rozwoju. Do normy ISO 20387 zostały opublikowane dodatkowe dokumenty z wytycznymi, wspomagającymi jej wdrażanie. Jednym z nich jest techniczny raport ISO/TR 22758 Biotechnologia – Biobankowanie – Przewodnik wdrożeniowy dla ISO 20387, który zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące wdrażania wymagań tej normy [9]. Nowy raport techniczny ma być uzupełnieniem, a nie substytutem ISO 20387, który wyszczególnia wymagania dotyczące kompetencji, bezstronności i spójnego działania biobanków. Wymagania ISO 20387 są już kompleksowe, więc uzupełniające wytyczne w ISO/TR 22758 pomogą organizacjom znacznie lepiej zrozumieć, jak wdrożyć normę oraz w pełni docenić korzyści biobankowania. Ponadto dostępna jest norma ISO 21899 Biotechnologia – Biobankowanie – Ogólne wymagania dotyczące walidacji i weryfikacji metod stosowanych do zapewnienia jakości materiałów biologicznych zdeponowanych w biobankach [7] oraz dokument ISO 21710 Biotechnologia – Biobankowanie – Specyfikacja dotyczącą zarządzania danymi i ich publikacji w MRC [6]. Drugi z powyższych dokumentów określa wymagania, umożliwiające spójne formatowanie oraz kontrolę jakości danych. Uwzględnia również zalecenia dla MRC dotyczące poprawy wymiany i integracji danych związanych z materiałem mikrobiologicznym. Ma on na celu ułatwienie procedur, takich jak deponowanie, pozyskiwanie, potwierdzanie, przechowywanie i dystrybucja szczepów, i może być wykorzystywany przez MRC w celu potwierdzenia lub uznania kompetencji w zakresie zarządzania danymi i ich publikacji. W lipcu 2022 została opublikowana norma ISO 24088-1 – Biotechnologia – Biobankowanie mikroorganizmów – Część 1: Bakterie i archeony. Obejmuje ona zagadnienia związane z pozyskiwaniem, przetwarzaniem, przechowywaniem i transportem dro-bnoustrojów należących do powyższych domen [8].

Ogromnym wyzwaniem dla centrów zasobów mikrobiologicznych jest przechowywanie i zarządzanie danymi. Obecne bazy danych zawierają głównie informacje o zasobach (identyfikacji, charakterystyce molekularnej i biochemicznej), a także ich historii (pochodzenie, nabycie itp.) oraz ich praktycznym zarządzaniu (ilości, miejscu przechowywania itp.). Dane te są punktem wyjścia do tworzenia katalogów, które mogą być oferowane klientom w formie on-line. Dzięki publicznie dostępnym katalogom zawierającym zbiór informacji o zasobach, możliwe jest swobodne posługiwanie się danymi (przeszukiwanie, rozpowszechnianie) w celu umożliwienia wewnętrznego zarządzania zasobami i prezentacji zasobów potencjalnym klientom.

Aby właściwie zarządzać danymi niezbędne są odpowiednie procedury. Zarządzanie danymi od dziesięcioleci stanowi istotny problem w działalności MRC. Bazy danych zawierające informacje na temat przechowywanego materiały biologicznego wymagają wydajnej i dobrze dostosowanej infrastruktury informatycznej. Przy braku zunifikowanych systemów informatycznych wymiana informacji jest znacznie utrudniona. Zarówno poziom komputeryzacji, jak i stosowane systemy informatyczne różnią się w zależności od rodzaju MRC. Stosowane są proste ale też i bardziej zaawansowane rozwiązania do zarządzania danymi, począwszy od prostych arkuszy kalkulacyjnych, po złożone platformy analityczne, zawierające także dane eksperymentalne i wykonujące proste analizy bioinformatyczne. Systemy informatyczne dedykowane biobankom powinny umożliwiać działanie za pośrednictwem oprogramowania integracyjnego, takiego jak systemy zarządzania przepływem pracy [21].

Norma ISO 20387 zaleca, by w biobanku istniała procedura wdrażania, modyfikacji i użytkowania oprogramowania, sprzętu komputerowego i baz danych systemu komputerowego. Procedura powinna obejmować co najmniej integralność danych, kontrole bezpieczeństwa i system awaryjny, aby zapobiec utracie lub uszkodzeniu danych.

Z kolei OECD rekomenduje aby BRCs/MRCs wybierały standardowe protokoły danych, umożliwiające bazom danych lepsze współdziałanie.

• Dane poufne powinny być jasno określone w związ-ku z możliwością uwierzytelniania użytkowników za pomocą technik szyfrowania i innych powią-zanych narzędzi do zabezpieczania informacji.

• System informatyczny powinien zapewniać regularne gromadzenie kopii zapasowych danych.

• Pożądane jest przechowywanie danych poza siedzibą firmy.

• Archiwa danych powinny być prowadzone zgodnie z polityką przechowywania zasobów biologicznych.

• BRCs/MRCs powinny wprowadzić odpowiednie środki (protokoły, narzędzia i standardy) we własnych systemach informatycznych w celu zapewnienia odpowiedniego bezpieczeństwa informacji. Podstawę takich środków może stanowić np. uwierzytelnianie za pomocą identyfikatora użytkownika i hasła, szyfrowanie wiadomości i/lub ograniczanie adresów IP.

• Pliki kopii zapasowych powinny być przechowywane w bezpiecznym miejscu.

• BRCs/MRCs powiny udostępniać dane opisujące materiał biologiczny i jego pochodzenie oraz udostępniać użytkownikom katalogi elektroniczne za pośrednictwem ich własnych systemów (np. strony internetowej) lub za pośrednictwem sieci krajowych, regionalnych lub globalnych.

  Dane powinny być przechowywane w celu zapewnienia zgodności z odpowiednimi krajowymi prze-pisami ustawowymi i wykonawczymi.

• BRCs/MRCs powinny ograniczać dostęp do katalogów elektronicznych, jeśli jest to stosowne. Użytkownicy katalogów powinni być uwierzytelnieni, a określone tożsamości i hasła powinny być dostarczane w celu uzyskania dostępu do różnych kategorii informacji i usług.

• Należy sprawdzać ważność identyfikatorów i haseł.

Według zaleceń WFCC katalogi szczepów dostępnych do dystrybucji (drukowane lub on-line) powinny być sporządzane lub aktualizowane w regularnych odstępach czasu. Coroczne wydawanie drukowanych katalogów jest nieuzasadnione, ale przerwy wynoszące pięć lub więcej lat byłyby zbyt duże, aby mogły być użyteczne. Katalogi on-line powinny być aktualizowane częściej. Kultury o ograniczonej dystrybucji powinny być wyraźnie oznaczone. Kultury, które z jakiegokolwiek powodu nie są dostępne do dystrybucji, nie powinny być wymieniane w katalogach lub publicznie dostępnych bazach danych.

W związku z rozwojem nowych narzędzi molekularnych, w tym technik wysokoprzepustowych, MRCs będą odgrywać kluczową rolę w koordynacji programów sekwencjonowania kwasów nukleinowych poprzez dostarczanie standaryzowanego i wysokiej jakości DNA szczepów. Będą one zatem odgrywały aktywną rolę w gromadzeniu, organizowaniu i utrzymywaniu zaktualizowanych danych genotypowych i fenotypowych uznanych za warte długoterminowego przechowywania. Dlatego idealnie byłoby, gdyby infrastruktura bioinformatyczna każdego MRC posiadała wewnętrzne systemy do obróbki danych wyjściowych ze zautomatyzowanymi platformami z danymi genetycznymi i fenotypowymi wraz z oprogramowaniem do podstawowej analizy porównawczej genomu i charakterystyki fenotypowej. Niemniej jednak zalecana jest możliwość połączenia wewnętrznych analiz z publicznie dostępnymi platformami bioinformatycznymi. Technologia sekwencjonowania nowej generacji (NGS), sekwencjonowanie RNA oraz podejścia transkryptomiczne i metagenomiczne, wykładniczo zwiększyły wykrywanie różnorodności biologicznej drobnoustrojów [5]. Ujawniają one w próbkach środowiskowych dużą liczbę nieopisanych gatunków, często niemożliwych do wyhodowania w warunkach laboratoryjnych. Na przykład technika NGS została wykorzystana do odkrycia nowych linii grzybów, które nie zostały wcześniej opisane [11]. Dane NGS zwiększają również możliwość „porównania całego genomu” w celu lepszego przypisania blisko spokrewnionych taksonów drobnoustrojów, tym samym poprawiając analizę relacji genotyp– fenotyp między różnymi szczepami. Ponadto pojawienie się trzeciej generacji NGS (PacBio i Oxford Nanopore) zwiększyło dostępność kompletnych genomów, szczególnie u bakterii, oferując w ten sposób cenne narzędzie do badania rearanżacji chromosomów, powtórzeń i translokacji. Warto zauważyć, że wraz ze stopniowym zmniejszaniem kosztów NGS oczekuje się, że identyfikacja nowych gatunków będzie oparta na całym ich genomie [3].

Biobanki przechowując setki milionów próbek biologicznych, w tym pochodzące od ludzi, zwierząt, roślin i drobnoustrojów, pomagają globalnej społeczności naukowej rozwijać wiele obszarów działalności człowieka, od produkcji roślinnej po spersonalizowaną medycynę [13].

Kolekcje kultur powinny zatem wyjść poza kontekst historyczny („botaniczny”) opracowując produkty komercyjne i rozwiązania biotechnologiczne poprzez badania przesiewowe i selekcję odpowiednich szczepów, a także finansowanie badań przez inwestycje publiczne/prywatne oraz tworzenie spółek typu spin-off [24].

Dostępność certyfikowanych szczepów drobnoustrojów musi być punktem wyjścia do wyboru materiału biologicznego przydatnego dla wykorzystania w nowoczesnej biotechnologii [2, 4, 15]. W tym kontekście rola MRCs i CCs ma zasadnicze znaczenie w zachowaniu biozasobów i dotyczących ich danych, które mają być wykorzystane na potrzeby badań, innowacji i rozwoju [1]. W rzeczywistości ogromna różnorodność biologiczna zachowana w CCs zapewnia wysokie prawdopodobieństwo odszukania wyjątkowych szczepów o pożądanych właściwościach. Nowoczesne podejście w badaniach i rozwoju biotechnologii powinno również gwarantować, że kultury mikroorganizmów opisane lub wymienione w publikacjach i wnioskach patentowych są publicznie dostępne dla niezależnych badań [25].

CCs i MRCs w przyszłości będą również odpowiedzialne za ochronę niehodowlanych mikroorganizmów VBNC (viable but non culturable), konsorcjów drobnoustrojów (złożonych próbek gleby, osadów, wody itp.), w tym ich mikrobiomów. Przed centrami zasobów mikrobiologicznych stoi wiele ważnych wyzwań, aby chronić różnorodność mikrobiologiczną dla przyszłych pokoleń.